摘要：質(zhì)粒DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)過(guò)熱擊處理，促進(jìn)吸收DNA。然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，再在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

  一、實(shí)驗(yàn)原理

  質(zhì)粒DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面,經(jīng)過(guò)42°C短時(shí)間的熱擊處理，促進(jìn)吸收DNA。然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá)，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

  二、實(shí)驗(yàn)器材

  旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯?，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺(tái)，酒精燈，玻璃涂棒，電熱恒溫培養(yǎng)箱。

  三、實(shí)驗(yàn)試劑

  培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無(wú)ddH2O，IPTG，X-gal。

  四、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

  無(wú)菌ddH2O，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配）。

  五、操作步驟

  （1）事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。

       （2）從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管（100μl）感受態(tài)菌,插入冰上融化，冰浴5~10min。

  （3）加入5μL連接好的質(zhì)粒混合液（DNA含量不超過(guò)100ng），輕輕震蕩后放置冰上20min。

  （4）輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5min。

  （5）在超凈工作臺(tái)中向上述各管中分別加入500μL LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h。

  （6）在超凈工作臺(tái)中取上述轉(zhuǎn)化混合液100~300μL，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過(guò)的玻璃涂布棒涂布均勻（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂）。

  （7）如果載體和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μL 20% IPTG，用酒精燈燒過(guò)的玻璃涂布棒涂布均勻。

  （8）在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過(guò)來(lái)放入37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜。

  （9）在桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

  （10）觀察平板上長(zhǎng)出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開(kāi)為好，注意白色菌斑。