初生母牛的卵巢中,約含有十至三十萬個卵母細胞,隨著成長過程,卵巢逐漸增大,重量亦隨之增加。卵母細胞的來源可以經由屠宰場取得的卵巢,采集卵巢上未成熟的卵母細胞,經體外培養(yǎng)使其成熟,或應用超音波掃描以觀察濾泡發(fā)育狀態(tài),自活體吸取卵母細胞。
胚的體外生產系統(tǒng)包含:卵的體外成熟、體外受精及胚的體外培養(yǎng)等三大部分。早期研究體外受精技術甚為困難,一九九○年時,美國及加拿大經由體外受精生產的小牛,總數(shù)不超過一百頭。
活體取卵是近十年來新發(fā)展的技術,經過不斷地改善,已經有商業(yè)化的儀器與設備供應。這些設備需要超音波儀,并配備固定功率的探頭,以及真空幫浦和采卵針。從超音波儀看到小濾泡時,立即將采卵針刺進小濾泡,負壓作用即將濾泡液和卵母細胞吸入離心管內。母牛每周以采集兩次所得的卵母細胞品質較好,數(shù)量也較多。平均每次約可收集到10個卵母細胞。
當牛只發(fā)育成長,排卵前卵子重新進行減數(shù)分裂,使核增大。濾泡成熟的過程,需經過初級、次級、三級的發(fā)育階段,最后始成為成熟濾泡,當卵子由成熟的濾泡排出時稱為排卵。
在濾泡成熟的后期,卵母細胞也逐漸成熟,細胞核亦進行減數(shù)分裂,達到第一次減數(shù)分裂中期的階段,稱為初級卵母細胞。初級卵母細胞再經一次減數(shù)分裂,即分裂為次級卵母細胞以及一個稱為第一極體的較小細胞,此時達到第二次減數(shù)分裂中期。細胞分裂的過程中,當有第一極體排出時,即顯示核已達到成熟,可以準備受精,這是重要的標記,利用立體顯微鏡即可觀察到。發(fā)育成熟的次級卵母細胞,經排卵并被受精后,再繼續(xù)完成其減數(shù)分裂,直到排出第二極管后才會進行一般細胞的有絲分裂,發(fā)育成為早期胚。
從屠宰場取得的卵母細胞,必須經過體外成熟階段才能進行受精。體外成熟的培養(yǎng)液一般采用組織培養(yǎng)液如TCM199,另外再添加胎牛血清,它有促進卵子體外成熟及確保較佳的卵裂效果。
發(fā)生受精作用之前必先經過獲能,這是一個非常復雜的生理變化過程。在體內受精情形下,必須先在雌性生殖道中,經過數(shù)小時的獲能準備才有受精的能力;在這段期間中,發(fā)生的生理生化改變,包括去除表面附著的抗原物質,以及進行頭帽反應,尤其是在頭帽內至少要有四種酵素的激活和釋放。欲穿過卵子的透明帶,必須要靠這些酵素來溶解卵丘細胞團及透明帶。
體外受精即是將已經完成獲能的和成熟的卵母細胞,共同置于受精用溶液中,然后將之靜置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。
受精完成并卵裂為二至四細胞的受精卵稱為胚。經體外受精后的早期胚,在繼續(xù)卵裂發(fā)育的過程中,會發(fā)生發(fā)育阻滯現(xiàn)象。不同的動物出現(xiàn)細胞發(fā)育阻滯的時期不同,牛羊為八至十六細胞期,豬為四細胞期,小鼠為二細胞期。因此如何克服牛的細胞發(fā)育阻滯現(xiàn)象,確保其發(fā)育能越過十六細胞期,是早期研究的重點。最早是利用兔子的輸卵管,將受精完成并卵裂的牛胚,移入已結扎的兔子輸卵管中,移植后第五天,再從兔子的輸卵管回收已發(fā)育至桑椹期或囊胚期的胚,再進行胚移置到受胚牛。
目前用來克服早期胚在體外發(fā)生發(fā)育阻滯的方法,是采用細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。將胚與卵丘細胞、輸卵管上皮細胞或子宮上皮細胞等體細胞共同培養(yǎng),即可克服發(fā)育阻滯現(xiàn)象,使胚能繼續(xù)發(fā)育,直到成為桑椹期或囊胚期,再做移置。
當母牛的生理周期與胚發(fā)育階段不一致時,移入的胚不能順利發(fā)育,而導致懷孕失敗,因此必須利用內泌素對牛只進行處理,來調整母牛的發(fā)情周期使之同期化。其目的在使母牛于預定的時間集中發(fā)情,以便實施有計畫的胚移置工作,提高受胎率。
同期發(fā)情處理應用的內分泌素有多種選擇,常用的是前列腺素;其功能是當卵巢有黃體存在時,經注射前列腺素后即被消解,于是在二至三天內又能誘發(fā)一個新的發(fā)情周期,因此能掌控排卵時間及胚移置的最佳進行時機。
當新鮮胚移置時,供胚牛與受胚牛的卵巢和子宮生理狀態(tài)亦必須一致,才有利于未來胚的持續(xù)發(fā)育及著床。胚在發(fā)育早期和子宮組織間尚未建立密切的關系,此一階段的發(fā)育,基本上是依靠本身儲存的養(yǎng)分,所以沖洗子宮后取得的胚,較易存活,一旦放回與供胚牛相似的受胚牛的子宮環(huán)境中,移置的胚即能繼續(xù)發(fā)育。
供胚牛與受胚牛的發(fā)情同期化程度,差異不得超過六小時,否則會降低受胎率;也就是說,供胚牛在發(fā)情、配種后七至八天取胚,受胚牛也應在相同時間接受移置。
在大型哺乳動物采用非手術法移置技術,此技術從一九七六年以后即廣泛應用于牛。牛胚移置的器材與人工授精相似,僅有口徑較小與長度較長的差異而已。移置前,將胚放入胚管并且裝入移置器;移置時,自生殖道插入移置器直到子宮頸外口,另一手則深入直腸找到子宮頸,緩緩配合將移置器送入子宮角內,并在預定的位置將胚注入。
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